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加入酶標(biāo)記檢測(cè)抗體的核心注意事項(xiàng)
使用酶標(biāo)記檢測(cè)抗體（常見的是酶標(biāo)二抗）是ELISA、WesternBlot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟。以下是需要重點(diǎn)關(guān)注的方面，分為實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后三個(gè)階段。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：抗體選擇與保存
特異性是關(guān)鍵
宿主來(lái)源：確保檢測(cè)抗體（二抗）所針對(duì)的宿主物種與一抗的宿主物種匹配。例如，小鼠來(lái)源的一抗應(yīng)選擇抗小鼠的酶標(biāo)二抗。
免疫球蛋白類型：確認(rèn)一抗的亞型（如IgG,IgM），并選擇針對(duì)該亞型的二抗，以獲得信號(hào)。
交叉吸附：在進(jìn)行多重檢測(cè)或樣本含有多種物種蛋白時(shí)，應(yīng)選擇經(jīng)過(guò)交叉吸附的二抗，以減少非特異性結(jié)合。
酶與底物系統(tǒng)的選擇
HRP（辣根過(guò)氧化物酶）：
優(yōu)點(diǎn)：成本低、靈敏度高、底物多樣（如TMB,DAB）。
注意事項(xiàng)：嚴(yán)禁使用含疊氮鈉（NaN?）的緩沖液，因?yàn)镹aN?是HRP的抑制劑。同時(shí)，要避免溶液被微生物污染。某些還原劑（如DTT）也會(huì)使其失活。
AP（堿性磷酸酶）：
優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，不受NaN?影響。
注意事項(xiàng)：應(yīng)避免使用含有磷酸根離子的緩沖液（如PBS），因?yàn)榱姿岣茿P的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。推薦使用Tris緩沖液。
抗體的保存與稀釋
正確保存：嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求保存，通常是-20℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。
使用前離心：短暫離心小管，將液體收集至管底，避免損失和起泡。
優(yōu)化稀釋比例：必須進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化二抗的稀釋比例。說(shuō)明書提供的范圍是一個(gè)參考起點(diǎn)。濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致背景深，濃度過(guò)低則信號(hào)弱。
二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中：孵育與洗滌
封閉要充分
在加入檢測(cè)抗體前，必須用惰性蛋白（如BSA、脫脂奶粉、血清等）對(duì)膜或板進(jìn)行充分封閉，以封堵非特異性結(jié)合位點(diǎn)，這是降低背景的關(guān)鍵。
孵育條件優(yōu)化
溫度與時(shí)間：室溫孵育1小時(shí)或4℃過(guò)夜。4℃過(guò)夜通常結(jié)合更牢固，背景更低，但需要更長(zhǎng)時(shí)間。室溫孵育更快捷，但需注意控制時(shí)間和溫度，避免背景過(guò)高。
避光：如果酶標(biāo)抗體偶聯(lián)了熒光染料，整個(gè)孵育過(guò)程需避光。
均勻孵育：確保抗體溶液能均勻覆蓋整個(gè)樣本，放在搖床緩慢搖動(dòng)孵育效果更佳。
洗滌至關(guān)重要
洗滌：孵育后，必須使用洗滌緩沖液（如TBST、PBST）進(jìn)行充分且嚴(yán)格的洗滌，以去除未結(jié)合的游離抗體。這是降低背景有效的一步。
洗滌次數(shù)與體積：通常建議洗滌3-5次，每次浸泡并搖動(dòng)3-5分鐘。使用足量的洗滌液。
三、實(shí)驗(yàn)后：顯色與結(jié)果分析
底物使用與顯色
新鮮配制：尤其是HRP的底物，建議在使用前新鮮配制，以保證其活性。
避光反應(yīng)：某些底物（如ECL）對(duì)光敏感，顯色反應(yīng)需在暗室進(jìn)行。
控制反應(yīng)時(shí)間：顯色反應(yīng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致背景過(guò)高。一旦達(dá)到理想的信號(hào)強(qiáng)度，應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)（對(duì)于ELISA）或進(jìn)行成像（對(duì)于WB）。
設(shè)立對(duì)照
陰性對(duì)照：不加一抗（只加封閉液和二抗），用于評(píng)估二抗的非特異性結(jié)合背景。
空白對(duì)照：不加一抗和二抗，用于評(píng)估底物自身的顯色情況。
陽(yáng)性對(duì)照：使用已知陽(yáng)性的樣本，確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)工作正常。
總結(jié)
成功使用酶標(biāo)記檢測(cè)抗體是一個(gè)系統(tǒng)性的優(yōu)化過(guò)程，核心在于：
選對(duì)（特異性）
用好（稀釋度、孵育條件）
洗凈（降低背景）
控好（底物反應(yīng)與對(duì)照）
遵循以上注意事項(xiàng)，將能顯著提高實(shí)驗(yàn)的可靠性、靈敏度和重復(fù)性。
注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢技術(shù)老師。
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